До конца 1940 года, когда в полной мере были усвоены уроки «битвы за Англию», конструкторское бюро Мессершмитта в Аугсбурге приступило к работе над самолетом, использующим новейшие достижения самолетостроения, включая полностью убираемое трехстоечное шасси, гермокабину и радиатор переменной площади сечения. Проект имел низкий приоритет – высшее командование люфтваффе считало в 1940 году, что срочной необходимости менять Bf.109 нет.
Главными чертами нового самолета должны были стать высочайшие скорости и огневая мощь. Проект получил в министерстве авиации обозначение Me.309. Учитывая многочисленные нововведения, было решено развернуть беспрецедентную исследовательскую программу, чтобы проверить все новые решения еще до полета первого опытного самолета. Проработка чертежей была закончена до начала 1942 года. К этому времени были проведены исследования на нескольких планерах Bf.109F, использовавшихся в программе Ме.309. Так Bf.109-V24 (№ 5604 VK+AB) использовался для продувок в аэродинамической трубе нового радиатора, Bf.109-V31 (№ 5642 SG+EK) использовался для испытаний радиатора и нового шасси с широкой базой, Bf. 109-V23 (№ 5603 CE+BP) использовался для испытаний различных передних стоек шасси, а Bf.109-V30 (№ 5716 ND+IE) и V30a (№ 5717 ND+IF) – для испытаний системы кондиционирования гермокабины.
Тем временем, по мере расширения боевого опыта интерес люфтваффе к Ме.309 снижался все больше и больше – ставку делали на установку на Bf.109 более мощных двигателей и вооружения, что не влекло задержек в работе сборочных линий. Тем не менее работа над опытным Me.309-V1 (№ 001 GE+CU) продолжалась. Самолет был готов в начале июня 1942 года. Наземные испытания были запланированы на 27 июня. С начала на закрепленном и загруженном балластом самолете провели прогоны двигателя. Уже этого было достаточно для задержки – из-за вибрации двигателя на слишком жестко закрепленном самолете полопались трубопроводы системы охлаждения. После решения этой проблемы начались рулежки на земле. При это выявилась серьезная вибрация носового колеса, а после доработки и вихляние самолета на больших скоростях рулежки.
Hаиболее серьезные проблемы с шасси удалось разрешить к середине июля. 18 июля состоялся первый полет самолета под управлением Карла Баура, но через семь минут полет был прерван из резкого роста температуры охлаждающей жидкости. Оказалось, что при наборе высоты, когда двигатель работал на максимальных оборотах, носовая стойка шасси значительно затеняла подфюзеляжный радиатор, а мощности гидравлики было недостаточно для быстрой уборки шасси. Эту проблему решили удвоением мощности гидравлики, сократив тем самым время затенения радиатора носовой стойкой. После доработки гидравлики, створок ниш шасси и элеронов, казалось все серьезные проблемы были решены. 07.09.1942 Me.309-V1 получил новый винт с возможностью реверса. Первый полет с ним состоялся на следующий день. Во время второй посадки в Лечфельде Баур использовал реверс винта сразу после косания. Торможение было на столько резким, что самолет развернуло, закрылки и руль высоты были повреждены, а после этого сломалась носовая стойка шасси. После ремонта испытания реверсивного винта прошли с большим успехом. Баур успешно отработал прием торможения самолета, который он  «эффектно» продемонстрировал перед комиссией – на рулежке перед наблюдателями Баур резко дал реверс и самолет тут же встал, а с голов членов комиссии слетели шляпы.
После завершения испытаний Мe.309-V1 был перегнан в Лейпхейм, для снятия взлетно-посадочных характеристик на бетонной полосе аэродрома. Летные испытания показали скорость отрыва при весе 3700 кг в 180 км/час, которая возрастала при весе 4100 кг до 200 км/час. Me.309-V1 на испытаниях все норовил сойти со взлетной полосы, а на больших скоростях был неустойчив на курсе. В результате опытный самолет получил новый киль увеличенной площади, первоначально планировавшийся для Me.309-V3. 11.11.1942 после этой доработки Me.309-V1 показали полковнику Адольфу Галланду, а 20 числа самолет был облетан в Рехлине испытателем RLM Беауваисом. Через два дня был проведен учебный бой с Bf.109G, который оказался более маневренным. Me.309 спасала только большая скорость полета.
Еще после одного полета Беауваис представил свой отчет: «Возможно, что Ме.309 после доводок будет вполне сносен, но для среднего пилота он все ровно будет представлять проблему, а посадка с носовым колесом представляет собой проблему даже для опытных пилотов. С полным вооружением самолет будет только на 50 км/час быстрее, чем Bf.109G, и вряд ли будет лучше новых самолетов (то есть, FW.190D), которые скоро появятся.»
Второй опытный Me.309-V2 (GE+CV) был облетан 29.11.1942. Hо при посадке носовая стойка сломалась, и самолет был списан. Me.309-V2 отличался от V1 только установкой вместо DB603A-1 нового DB605B. Последний в марте 1943 года был поставлен на Me.309-V1. Самолет к этому времени был оснащен новым килем – его меняли четыре раза, пока не добились полного удовлетворения. В марте 1943 года полетел Ме.309-V3 (GE+CW) с DB605B – он использовался для испытаний на больших скоростях. К этому времени программу испытаний было решено ограничить четырьмя опытными самолетами.
Четвертый и последний опытный самолет Me.309-V4 (RH+LH), который предназначался для испытаний вооружения, был готов и полетел в июле 1943 года. Me.309-V4 был оснащен двигателем DB605B и нес чрезвычайно мощное вооружение, которое «Messerschmitt» предлагала для «тяжелого» варианта истребителя. Самолет имел два синхронных 13-мм пулемета MG-131, по 20-мм пушке MG-151 и 13-мм пулемету MG-131 в корне каждого крыла и две 30-мм пушки МК-108 в консолях. МК-108 были частично скрыты под обтекателями на верхней поверхности крыла, по образцу испытанных на Bf.109-V31. С полным составом вооружения и с 880 л топлива Me.309-V4 весил 4875 кг, достигал скорости 575 км/час – на 15 % меньше расчетов Мессершмитта.
После заводских испытаний в Аугсбурге Me.309-V4 должны были перевести в Лейпхейм, но до этого его разбомбили союзники. Me.309-V3 позже использовался для испытания гермокабины и катапультируемого кресла для Ме.262, а на Me.309-V1 продолжались испытания трехстоечного шасси и реверсивного винта.
Перед прекращением работ над Ме.309 в проектах были несколько серийных вариантов самолета: Me.309A-1 – «легкий истребитель» с вооружением из двух 13-мм пулеметов MG-131 и 30-мм пушки МК-108; Me-309A-2 – «тяжелый охотник» c вооружением по образцу четвертого опытного самолета; пикирующий бомбардировщик Me.309B-1 с вооружением по образцу А-1 и держателями на пару 250-кг бомб под крыльями. Hа эти самолеты планировалось ставить двигатели DB603G взлетной мощностью 1900 л.с. и 1560 л.с. Hа высоте 7400 м, Jumo-213H взлетной мощностью 2650 л.с. и 2160 л.с. Hа высоте 7400 м. Еще одним возможным направлением развития был проект Ме.609 – спарки двух Ме.309 с помощью прямой секции крыла между двумя фюзеляжами.